세포 공학 기술

본문

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암 치료제와 코로나19 신속 진단 키트에 쓰이는 단일 클론 항체는 한 가지 항원의 한 부분에만 정확히 붙는다. 이런 항체를 만들려면 항체를 만드는 B 림프구를 암세포와 융합한 잡종 세포 가운데, 원하는 항체를 내는 세포 하나만 골라 그 자손을 키워야 한다. 그런데 수많은 세포가 섞인 배양액에서 세포를 정확히 하나씩 나누기는 쉽지 않다. 실험실에서는 어떤 방법으로 '하나에서 나왔음'을 보장할까?

우물 하나에 넣은 세포 수의 평균

그림 1. 세포 배양액을 묽게 하여 우물마다 평균 λ개의 세포가 들어가도록 나누었을 때, 우물에 든 세포 수의 비율(푸아송 분포). 평균을 1보다 작게 하면 세포가 자란 우물 대부분이 세포 하나에서 시작한 것이다.

먼저 알아야 할 것세포 융합과 조직 배양(생명과학), 확률과 확률 분포(수학), 림프구와 항체(림프구와 체액성·세포성 면역).

4.1.1세포 융합과 잡종 세포

항체를 만드는 B 림프구는 몸 밖에서 며칠밖에 살지 못한다. 반면 골수종이라는 암세포는 끝없이 분열하지만 항체를 만들지 못한다. 1975년 쾰러와 밀스타인은 항원을 주사한 생쥐의 B 림프구와 골수종 세포를 폴리에틸렌 글리콜로 융합했다. 융합된 잡종 세포(하이브리도마)는 B 림프구처럼 항체를 만들면서 암세포처럼 끝없이 분열한다. 융합되지 않은 골수종 세포는 특별한 배지에서 죽고, 융합되지 않은 B 림프구는 저절로 죽어, 잡종 세포만 살아남는다. 그런데 살아남은 잡종 세포들은 저마다 다른 B 림프구에서 왔으므로 서로 다른 항체를 만든다.

정리 4.1.1 한계 희석과 푸아송 분포

세포를 묽게 하여 우물마다 평균 \(\lambda\)개가 들어가게 나누면, 우물에 \(k\)개가 들어갈 확률은 \(P(k) = \dfrac{\lambda^k e^{-\lambda}}{k!}\)이다. 세포가 자란 우물 가운데 세포 하나에서 시작한 비율은 \(\dfrac{P(1)}{1 - P(0)} = \dfrac{\lambda e^{-\lambda}}{1 - e^{-\lambda}}\)이다.

그림 1에서 평균을 바꾸어 보자. 우물마다 평균 1개를 넣으면, 37%의 우물은 비고 37%는 하나, 26%는 둘 이상이 들어간다. 세포가 자란 우물 가운데 단일 클론은 58%밖에 안 된다. 평균을 0.3개로 줄이면 74%의 우물이 비지만, 자란 우물의 약 86%가 단일 클론이다. 빈 우물이 많아지는 손해를 감수하고 순도를 얻는 것이다. 그래서 한계 희석을 두세 번 되풀이해 단일 클론일 확률을 99% 넘게 높인다.¹

4.1.2다른 세포 공학 기술

세포 공학은 세포를 몸 밖에서 키우고, 합치고, 되돌리는 기술이다. 식물의 조직 배양은 잎이나 줄기의 작은 조각에서 식물 전체를 다시 키워, 병이 없는 똑같은 묘목을 많이 얻는다. 핵치환은 다 자란 세포의 핵을 핵을 뺀 난자에 옮겨 넣어 발생을 처음부터 다시 시작하게 한다. 1996년 복제 양 돌리가 이렇게 태어났다. 유도 만능 줄기세포(iPS 세포)는 피부 세포에 유전자 네 개를 넣어 배아 줄기세포처럼 무엇이든 될 수 있는 상태로 되돌린 것이다. 모두 다 자란 세포의 핵에도 몸 전체를 만드는 유전 정보가 그대로 있다는 원리 위에 서 있다.

그림 2. 세포 공학 기술은 세포의 유전 정보는 그대로 둔 채 그 상태와 조합을 바꾼다.

4.1.3예제 풀이

예제 4.1.2

96개의 우물이 있는 배양 접시에 잡종 세포를 우물당 평균 0.5개가 되도록 나누었다. 세포가 자라는 우물은 몇 개로 예상되며, 그 가운데 단일 클론은 몇 개인가? 같은 과정을 한 번 더 되풀이하면, 두 번 모두 단일 클론일 확률은 대략 얼마인가?

\(P(0) = e^{-0.5} \approx 0.607\), \(P(1) = 0.5e^{-0.5} \approx 0.303\)이다. 세포가 자라는 우물은 \(96 \times (1 - 0.607) \approx 38\)개, 그 가운데 단일 클론은 \(96 \times 0.303 \approx 29\)개이다. 자란 우물의 약 77%이다.

한 번 고른 우물이 단일 클론이 아닐 확률은 약 23%이다. 그 우물의 세포를 다시 한계 희석하면 그 안에서 또 한 세포만 골라지므로, 두 번 거친 뒤에도 섞여 있을 확률은 대략 \(0.23 \times 0.23 \approx 0.05\)로 줄어든다. 즉 약 95%가 단일 클론이 된다. 그래서 의약품용 항체를 만드는 회사는 한계 희석을 되풀이하거나, 현미경으로 우물마다 세포가 하나인지 직접 찍어 확인한다.

아래 탐구 카드에서 세포 융합, 핵치환, 역분화의 과정을 비교하고, 각 기술이 어떤 원리 위에 서 있는지 정리해 보자.

쾰러와 밀스타인은 단일 클론 항체를 만드는 방법에 특허를 내지 않았다. 그 덕분에 이 기술은 전 세계 연구실로 빠르게 퍼졌고, 두 사람은 1984년 노벨 생리의학상을 받았다.

마무리

세포 융합은 항체를 만드는 B 림프구와 끝없이 분열하는 골수종 세포의 성질을 합친 잡종 세포를 만들고, 한계 희석은 이 세포들을 묽게 나누어 한 세포에서 시작한 클론을 고른다. 우물마다 세포 수는 푸아송 분포를 따르므로, 평균을 1보다 작게 하고 과정을 되풀이할수록 단일 클론일 확률이 높아진다. 그래서 처음 질문의 단일 클론 항체는 확률 계산에 맞춘 한계 희석을 되풀이하여 세포 하나에서 시작했음을 보장한다.

탐구 1

잎이나 줄기 한 조각에서 식물 한 그루를 다시 키울 수 있을까?

실험 · 식물 조직 배양 · 옥신과 사이토키닌의 비율

절편

옥신(IAA) = 1 mg/L

사이토키닌(카이네틴) = 0.1 mg/L

절편 표면 살균 배지 고압 멸균 클린 벤치·기구 소독

스쿠그와 밀러(1957)의 담배 줄기 속 실험의 경향을 따른 모식 모형이다. 반응하는 농도와 비율은 식물 종류, 조직, 호르몬 종류에 따라 다르다. 지도의 막대는 기록한 조합마다 절편 10개 가운데 캘러스(갈색)·줄기(초록)·뿌리(파랑)가 생긴 비율이고, 붉은 × 는 오염된 절편이 있었다는 뜻이다.

탐구 문제잘라 낸 식물 조각을 영양 배지에 올려 두면 무엇이 자랄까? 같은 조각에서 줄기가 날지, 뿌리가 날지, 덩어리만 커질지는 무엇이 정할까?
복원식물 세포는 다 자란 뒤에도 조건만 맞으면 다시 분열하고 분화해 완전한 개체가 될 수 있다(전형성능). 분화를 멈추고 계속 분열하는 세포 덩어리를 캘러스라 한다. 옥신은 세포 신장과 뿌리 형성, 사이토키닌은 세포 분열과 눈(줄기) 형성을 촉진한다.
설계배지는 무기 염류·비타민·설탕 3%·한천 0.8%를 넣은 MS 배지이다. 조작 변인은 옥신과 사이토키닌의 농도, 종속 변인은 4주 뒤 캘러스·줄기·뿌리가 생긴 절편 수이다. 온도(25 °C), 빛(16시간), 절편 크기는 통제한다. 무균 과정은 70% 에탄올 30초 → 1% 차아염소산 나트륨 10~15분 → 멸균수로 3번 헹구기, 배지 121 °C 15~20분 고압 멸균, 클린 벤치 안에서 화염·알코올로 소독한 기구 쓰기이다.
분석사이토키닌/옥신 비율이 높으면 줄기, 낮으면 뿌리, 비슷하면 캘러스만 자란다. 두 호르몬이 모두 거의 없으면 담배 절편은 잘 자라지 않는다. 즉 기관이 생기는 방향을 정하는 것은 한 호르몬의 양이 아니라 두 호르몬의 비율이다.
측정옥신을 1 mg/L로 두고 사이토키닌을 0부터 3 mg/L까지 바꾸며 배양하고, 다음에는 반대로 해 보자. 지도에서 줄기와 뿌리가 갈리는 경계는 대각선(비율 일정) 방향인가? 그다음 무균 과정을 하나씩 빼 보자.
오차·안전설탕이 든 배지는 곰팡이와 세균도 잘 키우므로, 무균 과정이 하나만 빠져도 며칠 안에 배지가 오염된다. 반대로 차아염소산 나트륨에 너무 오래 담그면 절편 자체가 상해 갈변한다. 차아염소산 나트륨은 피부와 눈을 상하게 하므로 장갑과 보안경을 쓰고, 알코올 램프 가까이에 에탄올 병을 두지 않는다. 이 카드의 반응 경계는 모식이므로, 실제로는 농도 조합을 촘촘히 바꿔 가며 직접 찾아야 한다.

확인조건이 달라지면

바이러스에 감염된 딸기 품종을 건강한 묘목으로 대량 번식하려 한다. 어느 방법이 알맞을까?

읽기 2

다 자란 세포 하나로 개체나 장기 세포를 다시 만들 수 있을까?

읽기 · 핵이식, 줄기세포, 세포 융합의 원리와 사례

우리 몸의 세포는 거의 모두 같은 유전체를 가지고 있다. 피부 세포도 눈이나 심장을 만드는 유전자를 모두 가지고 있는 셈이다. 그렇다면 분화가 끝난 세포의 시계를 되돌려 다른 세포나 새 개체를 만들 수 있을까? 세포 공학은 이 질문에 세 가지 방법으로 답해 왔다.

세포 공학의 세 가지 길. 세 방법 모두 ‘세포의 유전 정보는 그대로인데 어떤 유전자가 켜져 있느냐가 세포의 운명을 정한다’는 사실에 기대고 있다.

1핵이식, 분화한 세포의 핵도 개체를 만들 수 있다

1962년 거던은 아프리카발톱개구리 올챙이의 장 세포에서 꺼낸 핵을, 핵을 없앤 난자에 넣어 올챙이와 개구리를 얻었다. 분화한 세포의 핵에도 개체 전체를 만드는 유전 정보가 남아 있고, 난자의 세포질이 그 정보를 처음 상태로 되돌린다(재프로그래밍)는 뜻이다. 1996년 영국 로슬린 연구소는 6년생 양의 젖샘 세포를 핵을 뺀 난자와 전기 자극으로 융합해 복제 양 돌리를 태어나게 했다. 이 방법을 체세포 핵이식이라 한다. 이때 만든 융합 배아 277개 가운데 새끼로 태어난 것은 돌리 하나였다. 그 뒤 소, 돼지, 개(2005년, 스너피), 원숭이(2018년) 등이 복제되었다.

쓰임은 우수 품종 가축이나 특수 목적 동물(탐지견)의 복제, 멸종 위기종 보존 연구, 형질 전환 동물 생산이다.

한계

재프로그래밍이 불완전해 성공률이 대개 몇 % 이하이고, 태반 이상이나 거대 태아 같은 발생 이상이 잦다. 복제 개체의 미토콘드리아 DNA는 난자 제공자에게서 오므로 핵 제공자와 완전히 같지도 않다.

2줄기세포, 스스로 늘고, 여러 세포로 분화한다

줄기세포는 분열해 자신과 같은 세포를 만드는 자가 재생 능력과 다른 종류의 세포로 바뀌는 분화 능력을 함께 가진 세포이다. 분화할 수 있는 범위에 따라 나눈다.

종류	얻는 곳과 방법	분화 범위	장점과 한계
배아 줄기세포	배반포의 안쪽 세포 덩어리를 떼어 배양 (사람은 1998년, 톰슨)	만능성, 곧 태반을 뺀 몸의 모든 세포	분화 능력이 가장 넓음. 배아를 파괴해야 하는 윤리 문제, 남의 세포라 면역 거부, 미분화 세포가 남으면 기형종 위험
성체 줄기세포	골수, 제대혈, 지방 등에서 분리 (조혈 모세포, 중간엽 줄기세포)	다분화능, 곧 주로 그 조직 계열의 세포	윤리 문제가 적고 본인 세포를 쓸 수 있음. 수가 적고 분화 범위가 좁음. 조혈 모세포 이식은 이미 표준 치료
유도 만능 줄기세포 (iPS 세포)	체세포에 전사 인자 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc를 넣어 역분화 (생쥐 2006년, 사람 2007년, 야마나카)	만능성	배아가 필요 없고 환자 맞춤형 가능. 만드는 데 시간과 비용이 크고, c-Myc 같은 유전자나 배양 중 생긴 돌연변이로 종양 위험
체세포 복제 배아 줄기세포	환자 체세포 핵을 핵을 뺀 난자에 넣어 만든 배아에서 얻음 (사람은 2013년)	만능성	환자와 핵 유전자가 같음. 난자를 얻어야 하고 복제 배아를 만든다는 윤리 문제가 큼

거던과 야마나카는 ‘다 자란 세포도 만능 상태로 되돌릴 수 있다’는 발견으로 2012년 노벨 생리의학상을 함께 받았다. 2014년 일본에서는 iPS 세포로 만든 망막 색소 상피 세포를 노인성 황반 변성 환자에게 이식하는 첫 임상 연구가 이루어졌고, 그 뒤 파킨슨병, 심장병, 각막 질환 등으로 임상 시험이 넓어지고 있다. iPS 세포로 만든 오가노이드(작은 장기 모형)는 환자 맞춤 약물 시험에도 쓰인다.

3세포 융합, 두 세포의 장점을 한 세포에

서로 다른 두 세포의 막을 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 전기 펄스, 센다이 바이러스 등으로 합치면 두 세포의 유전 물질을 함께 가진 잡종 세포가 된다. 식물 세포는 세포벽이 있어 먼저 셀룰레이스와 펙티네이스로 벽을 녹여 원형질체를 만든 뒤 융합한다.

하이브리도마

항체를 만드는 B 세포와 끝없이 분열하는 골수종 세포를 융합해 한 종류의 항체(단일 클론 항체)를 계속 만드는 세포를 얻는다(1975년, 쾰러와 밀스타인). 진단 키트, 암·자가 면역 질환 치료제의 출발점이다.

체세포 잡종 식물

감자와 토마토의 원형질체를 융합한 ‘포마토’(1978년)처럼, 교배가 되지 않는 종 사이에서 잡종 세포를 만들 수 있다. 포마토 자체는 쓸모 있는 작물이 되지 못했지만, 같은 방법으로 야생종의 병 저항성을 재배종에 옮기는 연구가 이어졌다.

핵이식과의 관계

돌리를 만들 때도 체세포와 핵을 뺀 난자를 전기 펄스로 융합했다. 세포 융합은 다른 세포 공학 기술의 도구이기도 하다.

4세포와 조직의 배양, 모든 기술의 바탕

세 방법 모두 세포를 몸 밖에서 살리고 늘리는 배양 기술 위에 서 있다. 식물은 분화한 세포도 개체 전체를 만들 수 있는 전체 형성능이 커서, 생장점을 배양해 바이러스가 없는 모종(무병묘)을 대량으로 얻고, 캘러스에서 약용 물질을 생산한다. 동물 세포는 무균 조건, 37 °C, 5 % CO₂, 혈청이나 성장 인자가 든 배지가 필요하며, 바닥을 다 덮으면 나눠 옮겨야(계대 배양) 한다. 오늘날 항체 의약품의 상당수는 거대한 배양 탱크에서 키운 햄스터 난소 세포(CHO 세포)가 만든다.

판단‘복제 개체는 핵 제공자와 똑같다’는 생각은 틀렸다. 핵 유전자가 같아도 미토콘드리아 DNA, 자궁 환경, 후성 유전적 표지, 자라면서 겪는 경험이 다르므로 생김새와 성격이 다를 수 있다. 또 iPS 세포가 배아 줄기세포의 윤리 문제를 크게 줄였지만, 둘이 완전히 같지는 않다. 원래 세포의 후성 유전적 기억이 남아 분화 효율이 달라지기도 한다.

확인조건이 달라지면

흑색 털 생쥐 A의 피부 세포 핵을 흰색 털 생쥐 B의 핵을 뺀 난자에 넣고, 갈색 털 생쥐 C의 자궁에 이식해 새끼를 얻었다. 새끼에 대한 설명으로 옳은 것은?

탐구 3

항체를 만드는 세포와 죽지 않는 암세포를 합친 뒤, 원하는 세포만 어떻게 골라낼까?

세포 융합 · 하이브리도마 · HAT 선택과 한계 희석 · 모식

융합 뒤 배양 10일째

B 세포 B–B 융합 골수종 골수종–골수종 융합 하이브리도마

하이브리도마 (상대 수): —
골수종 계열 (상대 수): —
살아 있는 세포 중 하이브리도마: —

② 한 세포에서 시작한 클론 얻기. HAT에서 살아남은 세포를 96홈 판에 희석해 나눠 담는다.

한 홈에 들어가는 평균 세포 수 λ = 1.0

세포가 자란 홈: —
그중 세포 1개에서 시작: —
이론값 P(1개 | 자람): —

모식 모형이다. 처음 세포 수는 생쥐 비장 세포 약 10⁸개와 골수종 세포 2 × 10⁷개를 PEG로 융합한 실험의 자릿수에 맞춘 상대값이고, 쓸 만한 하이브리도마가 10⁵개 가운데 1개꼴로 생긴다고 두었다. 배가 시간 약 1일, 배양 용량의 한계를 넣었다. 홈에 들어가는 세포 수는 푸아송 분포로 뽑았다.

질문항원을 주사한 생쥐의 B 세포는 원하는 항체를 만들지만, 접시에서는 며칠 만에 죽는다. 골수종(암이 된 형질 세포)은 끝없이 분열하지만 원하는 항체를 만들지 못한다. 두 세포를 합친 세포만 골라 키울 수 있다면 한 종류의 항체를 무한히 얻을 수 있다. 그런데 융합에 성공하는 세포는 십만 개에 하나꼴이다. 나머지를 어떻게 없앨까?
복원B 세포 하나는 한 가지 항원 결정기에만 붙는 항체를 만든다. 세포는 DNA 재료인 뉴클레오타이드를 두 길로 얻는다. 하나는 작은 분자로부터 처음부터 짓는 새로 합성 경로이고, 다른 하나는 이미 있는 염기(하이포잔틴)와 뉴클레오사이드(티미딘)를 재활용하는 재활용 경로이다. 재활용 경로에는 HGPRT(하이포잔틴–구아닌 포스포리보실 전달 효소)와 TK(티미딘 인산화 효소)가 필요하다.
설명폴리에틸렌 글라이콜(PEG)이나 전기 펄스로 두 세포의 막을 합치면 핵 두 개를 가진 세포가 되고, 분열하면서 염색체가 한 핵에 모인다. 이것이 세포 융합이다. HAT 배지는 하이포잔틴(H), 아미노프테린(A), 티미딘(T)을 넣은 배지이다. 아미노프테린은 새로 합성 경로를 막으므로, 세포는 재활용 경로로만 살아야 한다. HGPRT가 없는 골수종과 골수종끼리 융합한 세포는 죽는다. B 세포와 B–B 융합 세포는 HGPRT가 있지만 분열 능력이 없어 저절로 사라진다. B 세포의 HGPRT 유전자와 골수종의 무한 증식 능력을 함께 가진 하이브리도마만 남는다.
연결HAT에서 살아남은 세포는 여러 B 세포에서 온 섞인 집단이다. 그래서 희석해 홈마다 세포 하나가 들어가게 나눠 담고(한계 희석), 효소 결합 면역 분석(ELISA)으로 원하는 항체를 내는 클론을 고른다. 홈에 들어가는 세포 수가 평균 λ인 푸아송 분포를 따르면, 세포가 자란 홈이 한 세포에서 시작했을 확률은 λe^−λ / (1 − e^−λ)이다. 이렇게 얻은 항체가 단일 클론 항체이며, 쾰러와 밀스타인이 1975년에 처음 만들었다(1984년 노벨 생리의학상).
적용일반 배지와 HAT 배지에서 10일째 하이브리도마의 비율을 비교해 보자. 이번에는 HGPRT가 정상인 골수종을 써 보자. 선택이 왜 실패하는가? 아래 판에서 λ를 3, 1, 0.3으로 바꾸며 ‘세포 1개에서 시작’의 비율을 이론값과 비교해 보자. 단일 클론을 확실히 얻으려면 λ를 어떻게 정하고, 그 대가는 무엇인가?
판단HAT 선택은 골수종을 없애 줄 뿐 원하는 항체를 내는 클론을 골라 주지는 않는다. 그 일은 ELISA 같은 선별 검사가 한다. λ를 낮춰도 단일 클론일 확률은 1이 되지 않으므로 실제로는 한계 희석을 두세 번 되풀이한다(재클론화). 또 생쥐 항체를 사람에게 반복해 주면 면역계가 이를 이물질로 공격하므로, 오늘날 치료용 항체는 사람화 항체나 완전 사람 항체로 만든다.

확인조건이 달라지면

HGPRT는 정상이지만 TK(티미딘 인산화 효소)가 없는 골수종 세포주를 B 세포와 융합했다. HAT 배지에서 어떤 일이 일어날까?